微生物限度檢查操作的若干問(wèn)題
除微生物制劑外，藥品微生物限度檢查與藥品中有效成分的含量測(cè)定顯著不同，其檢查對(duì)象具有以下特點(diǎn)：
1 活體易變性
菌細(xì)胞在藥品中處于不穩(wěn)定狀態(tài)，可隨存放時(shí)間延長(zhǎng)死亡，也可在適宜條件下增殖。一批液體制劑若不含防腐劑，它可能是出廠時(shí)合格，貯存時(shí)不合格，zui終又可能“合格”。當(dāng)保存條件穩(wěn)定時(shí)，其污染量在一定時(shí)間內(nèi)處于動(dòng)態(tài)平衡，總體污染狀況可以標(biāo)準(zhǔn)化的條件予以正確評(píng)估。
2 分布不勻
除產(chǎn)品在生產(chǎn)前期污染外，通常是局部的。一批產(chǎn)品中不同瓶（盒）中污染狀態(tài)會(huì)出現(xiàn)差異，其污染量特別是致病菌通常是少量的。檢驗(yàn)樣品的代表性有賴于合理的抽樣方法。
3 多數(shù)處于受損傷狀態(tài)
藥品中污染的微生物，受到原料處理、加工等過(guò)程的影響，或者藥品本身對(duì)微生物的抑殺作用，使其受到一定程度的損傷，這些受傷的微生物用一般的方法檢查，往往會(huì)出現(xiàn)假陰性或計(jì)數(shù)偏低的結(jié)果。
4 生態(tài)環(huán)境多樣復(fù)雜
污染菌的來(lái)源多樣，種類多樣，加之藥品種類繁多、劑型成分復(fù)雜，同一種菌在不同的藥劑中所測(cè)得的結(jié)果各不相同。
微生物限度檢查必須遵循以下原則：
1樣品正式檢驗(yàn)前必須保持原污染狀態(tài)。防止第二次污染和防止污染微生物的繁殖或死亡。
2應(yīng)有適當(dāng)?shù)墓┰囈褐苽浞椒?。供試液的正確制備是保證檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的前提。
3檢驗(yàn)方法準(zhǔn)確可靠
4檢驗(yàn)結(jié)果判斷無(wú)誤
作好微生物限度檢驗(yàn)，檢驗(yàn)人員的職業(yè)品德和業(yè)務(wù)素質(zhì)至關(guān)重要。
建立科學(xué)的質(zhì)量保證體系，是獲取檢驗(yàn)結(jié)果正確可靠的基本保證。

一、檢驗(yàn)樣品保持原污染狀態(tài)
1 防止再污染無(wú)菌技術(shù)
設(shè)備和無(wú)菌操作（略）
2 防止再繁殖或死亡
21 樣品應(yīng)為未開(kāi)啟的原包裝、檢驗(yàn)前保存條件應(yīng)與藥品貯存條件相同。
22從樣品接觸稀釋劑至接種（注皿）應(yīng)在1小時(shí)內(nèi)完成，對(duì)多批樣品應(yīng)分段接種（注皿）。
23抑菌性藥品供試液制備，應(yīng)盡可能縮短制備時(shí)間并注意污染微生物的減失（離心、溫度）。

二、供試液制備

1稀釋劑藥典規(guī)定使用0.9%無(wú)菌氯化鈉及無(wú)菌磷酸鹽緩沖液，從保護(hù)菌細(xì)胞及有利菌細(xì)胞的恢復(fù)考慮，有必要研究改進(jìn)。
2量具衡器電子稱藥物天平感量應(yīng)小于0.1g
容器及吸管現(xiàn)無(wú)設(shè)備要求誤差小于1％
吸管1ml分度值0.01ml，10ml分度值0.1ml
口徑不大于2mm
3 稱（吸）量固體、半固體10g
液體10ml
膜劑以面積計(jì)
分散方式勻漿儀3000～5000rpm，2－4min
4稀釋固體加稀釋劑100ml，液體加稀釋劑90ml，與國(guó)外藥典規(guī)定有差別。樣品應(yīng)充分均質(zhì)或乳化分散在稀釋劑中。對(duì)膠囊、膠劑等先打碎再溶解，對(duì)栓劑及油劑加適量分散劑，對(duì)油膏基質(zhì)軟膏加適宜乳化劑，如司盤(pán)、單硬脂酸甘油酯、吐溫等。
抑菌性樣品：
菌數(shù)測(cè)定，目前未規(guī)定處理方法
控制菌檢查，水溶性樣品：薄膜過(guò)濾、稀釋、離心沉淀
混懸液：二次離心
乳濁液：離心法
滅活劑的使用需依品種分別測(cè)試
處理時(shí)間宜控制在zui短時(shí)間內(nèi)
稀釋方法：吸液在離液面25cm處，放液離第二管液面不高于1cm，管內(nèi)混和吹打不少于10次，瓶?jī)?nèi)振蕩混合不少于15s’。

三、方法和結(jié)果判斷

目前我國(guó)微生物限度檢查在方法標(biāo)準(zhǔn)化、靈敏度、科學(xué)性等方面與國(guó)外相比還存在一定差距，質(zhì)量保證體系的建立尚須作許多工作，現(xiàn)就我國(guó)現(xiàn)行方法提出一些問(wèn)題共同討論。
1 菌數(shù)測(cè)定
我國(guó)采用平板稀釋法
11 稀釋度我國(guó)現(xiàn)規(guī)定稀釋級(jí)至少為三級(jí)
三級(jí)稀釋度的平均菌落生長(zhǎng)數(shù)互為比照，能較為真實(shí)反映藥品中的污染菌量，防止錯(cuò)誤判斷，對(duì)于抑菌性藥品的菌數(shù)確定尤其重要。在10-1、10-2稀釋級(jí)不生長(zhǎng)或少生長(zhǎng)而在10－3級(jí)平板生長(zhǎng)的情況并不少見(jiàn)。
12陰性對(duì)照檢查用具、稀釋劑、培養(yǎng)基及檢測(cè)環(huán)境的本底狀態(tài)以確認(rèn)樣品檢驗(yàn)的可靠性，是檢驗(yàn)質(zhì)量保證的重要步驟。
13培養(yǎng)基培養(yǎng)基的質(zhì)量是菌數(shù)測(cè)定的關(guān)鍵因素。
培養(yǎng)基注皿量及培養(yǎng)溫度對(duì)菌數(shù)測(cè)定有影響
14點(diǎn)計(jì)實(shí)際工作中注意細(xì)菌、酵母菌及霉菌的區(qū)別，細(xì)菌與藥渣的區(qū)別，霉菌與藥物結(jié)晶的區(qū)別。
菌落蔓延、重疊、連線生長(zhǎng)情況的處理。
不能作為計(jì)數(shù)依據(jù)的幾種情況：三級(jí)平板菌落數(shù)不能顯示差別；當(dāng)平板平均菌數(shù)＞15時(shí)，二個(gè)平板菌落數(shù)相差1倍以上；平板平均菌落數(shù)≤15時(shí)二個(gè)平板的菌落數(shù)不在0-4''1-7''2-9''3-10''4-12''5-14''6-15范圍內(nèi)。
15報(bào)數(shù)報(bào)數(shù)規(guī)則的有關(guān)問(wèn)題
細(xì)菌數(shù)測(cè)定報(bào)數(shù)的舉例：
①、一個(gè)稀釋級(jí)平均菌落數(shù)在30－300時(shí)：
10-110-210-3處理原則報(bào)告數(shù)
13281取10－1320
26448取10－24400
322056繼續(xù)稀釋
②、二個(gè)稀釋級(jí)平均菌落數(shù)在30－300時(shí)：
10-110-210-3處理原則報(bào)告數(shù)
1280428比值≤2''取10－210－2平均值3500
230013034比值2''取10－21300
③、三個(gè)稀釋級(jí)平均菌落數(shù)均不在30－300時(shí)：
10-110-210-3處理原則報(bào)告數(shù)
128012037取10－212000
229022040取10－210-3平均值31000
④、各稀釋級(jí)平均菌落數(shù)均不在30－300時(shí)
10-110-210-3處理原則報(bào)告數(shù)
1多不可計(jì)1560342取10－3340000
2310248取10－22400
328124取10-1280
412121
培養(yǎng)基稀釋法
5121
⑤、菌數(shù)報(bào)告不合理的舉例
10-110-210-3處理原則報(bào)告數(shù)
1302802010－2／10-1取10－2300
2422908010－3／10-2取10－229000
3322404210－3／10-2取平均值33000
16 復(fù)試復(fù)試是對(duì)菌數(shù)結(jié)果在合格邊緣的一種處理辦法。
17日常工作中幾種情況的處理：液體制劑發(fā)生爆破（或塑瓶膨脹）而常規(guī)檢查方法“合格”；相似菌落在二種平板上同時(shí)生長(zhǎng)；對(duì)生長(zhǎng)菌落數(shù)明顯不符合稀釋分布規(guī)律者。
2控制菌檢查
藥品中污染的控制菌數(shù)量少、分布不勻，且多受藥物影響呈亞致死狀態(tài)，適宜的增菌培養(yǎng)方法和高靈敏度的培養(yǎng)基是提高陽(yáng)性檢出率的關(guān)鍵。
為了保證試驗(yàn)方法的可靠性，藥典規(guī)定的陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照試驗(yàn)是必須的。陽(yáng)性對(duì)照菌須加入供試液中與供試品檢驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行平行試驗(yàn)。在試驗(yàn)中，當(dāng)已知陽(yáng)性菌不能檢出時(shí)，該項(xiàng)控制檢驗(yàn)結(jié)果無(wú)效，須認(rèn)真研究原因，重點(diǎn)考慮藥品的抑菌作用并制定滅活處理方法。
目前藥典規(guī)定的陽(yáng)性對(duì)照菌種，多為具有毒力的致病菌如乙型副傷寒沙門氏菌，破傷風(fēng)梭菌等，為防止試驗(yàn)中污染供試品檢驗(yàn)環(huán)境，作陽(yáng)性菌對(duì)照試驗(yàn)時(shí)應(yīng)與供試品檢驗(yàn)分開(kāi)進(jìn)行，使用操作間或接種臺(tái)。
（1）大腸桿菌檢查（略）
（2）沙門氏菌檢查
① 增菌培養(yǎng)預(yù)增菌營(yíng)養(yǎng)肉湯
增菌四硫磺酸鹽煌綠肉湯
沙門菌在增菌培養(yǎng)液中呈均勻混濁、無(wú)菌膜、無(wú)沉淀。
② 分離培養(yǎng)DHL''SS;EMB''MacC
疑似菌落為透明或半透明，無(wú)色（或微顯培養(yǎng)基色）
在含H2S指示系統(tǒng)培養(yǎng)基上菌落中心呈黑色
發(fā)酵乳糖的亞屬Ⅲ其菌落呈乳糖指示系統(tǒng)顏色
③ 初步鑒別疑似培養(yǎng)物在TSI上為K/AH2S＋，K/AH2S－，A/AH2S＋
④生化反應(yīng)
H2S賴氨酸脫羧酶靛基質(zhì)脲酶
沙門菌屬反應(yīng)＋＋--－
＋＋＋少見(jiàn)--
－＋--－
⑤血清凝集試驗(yàn)直接凝集試驗(yàn)＋
或煮沸30分鐘后凝集試驗(yàn)＋
⑥結(jié)果判斷革蘭氏陰性桿菌④及⑤兩項(xiàng)均符合報(bào)告檢出沙門菌
當(dāng)④及⑤兩項(xiàng)中一項(xiàng)不符合時(shí)進(jìn)一步檢驗(yàn)
當(dāng)④及⑤兩項(xiàng)均不符合時(shí)報(bào)告未檢出沙門菌
（3）金黃色葡萄球菌檢查
① 增菌培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)肉湯、亞碲酸鈉肉湯，均勻混濁，稍有沉淀
② 分離培養(yǎng)卵黃氯化鈉平板，甘露醇氯化鈉平板，血平板
疑似菌落金黃色、圓形凸起，邊緣整齊，光滑濕潤(rùn)，有乳濁圈（卵黃氯化鈉平板），黃色環(huán)（甘露醇氯化鈉平板）、透明溶血環(huán)（血平板）
③ 生化試驗(yàn)及染色血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性
G＋球菌
④ 結(jié)果血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性，G＋球菌，報(bào)告陽(yáng)性檢驗(yàn)結(jié)果
（4）銅綠假單胞菌
增菌培養(yǎng)膽鹽乳糖培養(yǎng)基液體表層生長(zhǎng)旺盛、有菌膜
分離培養(yǎng)溴代十六烷*胺平板
疑似菌落灰白色扁平、圓或無(wú)定形，邊緣不齊，周邊呈擴(kuò)散現(xiàn)象，典型者菌落周圍呈藍(lán)綠色。
生化試驗(yàn)及染色G－桿菌
①氧化酶試驗(yàn)＋
②綠膿菌素試驗(yàn)＋
③硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)＋
④明膠液化試驗(yàn)＋
⑤41℃生長(zhǎng)試驗(yàn)＋
結(jié)果G－桿菌①及②陽(yáng)性作出陽(yáng)性結(jié)果報(bào)告
G－桿菌①陽(yáng)性②陰性
則③、④、⑤皆為陽(yáng)性作出陽(yáng)性結(jié)果報(bào)告
（5）破傷風(fēng)梭菌檢查
為厭氧梭菌，須以厭氧培養(yǎng)法檢查
厭氧培養(yǎng)方法冷觸媒法
焦性沒(méi)食子酸法
增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)產(chǎn)氣、臭味、肉渣消化
染色鏡檢典型者為鼓槌樣芽孢桿菌
毒力試驗(yàn)當(dāng)增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)出現(xiàn)疑似培養(yǎng)物時(shí)須作毒力試驗(yàn)，當(dāng)染色鏡檢發(fā)現(xiàn)疑似破傷風(fēng)梭菌者，*次毒力試驗(yàn)陰性時(shí)應(yīng)連續(xù)進(jìn)行二次增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)，并接種新霉素血平板，刮取疑似菌作增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)。
結(jié)果毒力試驗(yàn)陽(yáng)性，不論鏡檢是否發(fā)現(xiàn)疑似破傷風(fēng)梭菌，均作出陽(yáng)性檢驗(yàn)報(bào)告

平板細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)置信區(qū)間

菌落總數(shù) 平均值 標(biāo)準(zhǔn)差 95％置信區(qū)間 99置信區(qū)間 范圍
   下限   上限  下限  上限 
1 05000 05000 0013 1844 0003 2639 
2 10000 07071 0121 2786 0052 3715 
3 15000 08660 0309 3612 0169 4637 0-4
4 20000 10000 0545 4384 0336 5489 
5 25000 11180 0812 5127 0539 6297 
6 30000 12247 1101 5834 0768 7075 
7 35000 13229 1407 6530 1019 7830 1-7
8 40000 14142 1727 7211 1286 8567 
9 45000 15000 2058 7882 1566 9289 
10 50000 15811 2398 8542 1858 9999 2-9
11 55000 16583 2746 9195 2161 10699 
12 60000 17321 3100 9841 2472 11390 
13 65000 18028 3461 10481 2790 12072 3-10
14 70000 18708 3827 11115 3115 12748 
15 75000 19365 4198 11745 3447 13410 4-12
16 80000 20000 4573 12370 3783 14082 
17 85000 20616 4952 12992 4125 14741 
18 90000 21213 5334 13609 4472 15395 5-14
19 95000 21794 5720 14224 4822 16045 
20 100000 22361 6108 14835 5177 16691 6-15
21 105000 22913 6500 15444 5535 17334 
22 110000 23452 6894 16050 5896 17973 
23 115000 23970 7290 16654 6260 18609 7-17
24 120000 24495 7689 17256 6628 19242 
25 125000 25000 8089 17855 6998 19873 8-18
26 130000 25495 8492 18452 7370 20509 
27 135000 25981 8897 19040 7745 21125 9-19
28 140000 26458 9303 19642 78123 21740 
29 145000 26926 9711 20234 8052 22369 10-20
30 150000 27386 10120 20824 8884 22983